禹重科技-行业应用
基于Orbitrap强大的功能,其应用领域非常广泛。本期向大家介绍另一蛋白质研究领域生物制药的最新进展。
一、 新方法_针对残留宿主细胞蛋白的鉴定
残留宿主细胞蛋白是抗体药物产品中主要的过程相关杂质,影响抗体药物的安全性和有效性,ICH Q6B指导方针中指出多种检测方法相结合证明杂质的清除。残留HCPs的含量视具体药物而定,一般要求在1 to 100 ng/mg or ppm范围内。ELISA是最经典传统的方法对HCPs进行定性和定量,众所周知也有很多的不足;随着质谱技术的不断创新,方法的优化,LC-MS/MS分析方法已成为强有力的工具对HCPs进行高通量、高准确度的定性定量。为满足工业化生产需求,要求LC-MS/MS解决方案必须具有高稳定性、分析速度快的特点,才能广泛的用于抗体生产纯化的过程中。优化的LC-MS/MS分析方法如下:
成分分析方案|表面分析方案|样品前处理系统|表面分析方案|硬度测试|力学测试|标准样
1、三根色谱柱串联鉴定HCPs “Evaluation of factors affecting detection of host cell proteins in biotherapeutic proteins using an Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer”
将三根Thermo Scientific™ Acclaim™ columns (C18, 250mm * 2.1 mm; 2.2 um)色谱柱串联使用,洗脱时间共260min,SMART Digest kit酶解NIST标准蛋白,总上样量62.5ug,鉴定效果与文献中600ug上样量的2D-LC-MS/MS方法相当,且该1D方法更稳定,上样量更少,分析时间更快,可满足工业化大批样品杂质鉴定的需求,实验所需设备如图1。详细信息见2017 ASMS ThermoFisher
Figure 1. Data were collected using a Vanquish UHPLC (a) coupled to a Fusion mass spectrometer (b) and processed with Proteome Discoverer software (c). The 3 columns (d) fit in the Vanquish UHPLC column compartment
2、 “限制性酶切” “A Novel Sample Preparation for Shotgun Proteomics Characterization of HCPs in Antibodies[J]. Analytical Chemistry, 2017, 89(10).”
抗体在native状态下酶解时,几乎保留抗体完整状态,而HCPs被酶解完全,从而提高质谱检测的动态范围,最低可检测定量到0.5ppm的HCP。以NIST标准抗体为例,与经典的2D-LC-MS/MS方法相比,在近2h的分析时间内能够鉴定到其所有HCPs,且高可信度的多鉴定并定量到2倍数目的HCPs。并在450天内进行70次的分析,证明该方法具有高的稳定性,实验流程见图2。
Figure 2. Schematic of the Experimental Workflow
二、 新设备_ZipChip毛细管电泳
毛细管电泳分离技术与液相分离相比,具有分析速度快,有效分离完整蛋白的电荷变异体,氨基酸异构体,单糖、聚糖、糖肽,非常亲水性分子,以及较少的样品制备(如样品无需脱盐)等特点。ZipChip毛细管电泳系统(图3)是将毛细管电泳(CE)和(ESI)电喷雾集成到微流控芯片上,与MS相连不需要额外的接口。具有体积小,操作简单,分析速度非常快(<3min),低上样量(fg-ng)等特点。与高分辨质谱Orbitrap联用,快速分离的同时获得高分辨数据。
Figure 3. Structure of ZipChip
应用实例1_CE-MS联用快速有效分离、并准确测定抗体的电荷变异体(如图4),上样量3ng同样获得高信噪比的数据。
Figure 4. The ZipChip™ system coupled with the Q Exactive™ BioPharma platform is unique and powerful to separate and identify different intact antibody charge variants in native and denatured conditions
应用实例2_CE-MS联用快速有效分离、并准确鉴定抗体的氨基酸序列(如图5),10min的分离时间即可获得近100%的氨基酸序列覆盖度。
三、新形式_Native WCX-MS联用表征完整蛋白
Native ion exchange chromatography directly coupled to Orbitrap mass spectrometry allows surface charge discrimination and online detection of intact proteins
传统的WCX由于含有不挥发性盐不能与质谱联用,而此处Native WCX是指使用ProPac WCX-10弱阳离子交换柱,流动相A为50mM乙酸铵 PH=7,流动相B为50mM乙酸铵 PH=10,利用PH梯度对抗体的电荷变异体进行洗脱(如图6)。与已报道的传统WCX-UV谱图相比具有高度的一致性(如图7)。此方法可高效的、高重现性的分析抗体电荷变异体。
Figure 6. Native WCX-MS analysis of commercial antibody standards. (A) WCX-MS analysis of NIST monoclonal antibody standard shows separation of known C-terminal lysine variants yields clean mass spectra. (B) WCX-MS analysis of SigmaTM SILuTM-Lite mAb shows contributions of both acidic and basic variants which can affect mass accuracywithout chromatographic separation.
Figure 7. Previously published salt-elution WCX-UV data shows similar chromatography as pH-elution WCX-MS method.
这两期的内容希望对大家有所帮助,更高效的完成科研、生产工作。
文章来源:Orbitrap组学俱乐部
编辑:亚析
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