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简单的说，PCR就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内In Vitro的大量合成，基本上它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制。

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目前，常用的技术，可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。根据DNA扩增的目的和检测的标准，可以将PCR仪分为普通PCR仪，梯度PCR仪，原位PCR仪，实时荧光定量PCR仪四类。

PCR产物的电泳检测时间　　

一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。

PCR反应的关键环节

①板核酸的制备

②引物的质量与特异性

③酶的质量

④PCR循环条件，寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究

酶切分析：

根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。 　　

分子杂交：

分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR产物碱基突变的有效方法。

Southern印迹杂交：

在两引物之间另合成一条寡核苷酸链（内部寡核苷酸）标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。　　

斑点杂交：

将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。

氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。

一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。

RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止R-Nase降解RNA。

温度与时间的设置：

基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。

在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。

对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸（此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性）。

实验操作注意事项：

尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意： 

1.戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套； 

2.使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染； 

3.避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面； 

4.操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度； 

5.最后加入反应模板，加入后盖紧反应管； 

6.操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性； 

7.尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。

如没有这种特殊的加样器，至少PCR操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区； 

8.重复实验，验证结果，慎下结论。

PCR扩增仪的保养与注意事项

PCR仪器不是一种计量仪器，其主要作用原理与基本计量要素密切相关，要求较高，一旦失控，仪器将不能正常工作，所以PCR仪器也需要定期检测和维护，这对依赖自然风降温的PCR仪器尤为重要。PCR扩增仪的保养和注意事项。

下面介绍一些具体的保养维护方法：

1.样品池的清洗先打开盖子，然后用95%乙醇或10%清洗液浸泡样品池5min，然后清洗被污染的孔；用微量移液器吸取液体，用棉签吸干剩余液体；打开PCR仪，设定保持温度为50℃的PCR程序并使之运行，让残余液体挥发去除。一般5～10min即可。

2.热盖的清洗对于荧光定量PCR仪，当有荧光污染出现，而且这一污染并非来自样品池时，或当有污染或残迹物影响到热盖的松紧时，需要用压缩空气或纯水清洗垫盖底面，确保样品池的孔干净，无污物阻挡光路。

3.仪器外表面的清洗清洗仪器的外表面可以除去灰尘和油脂，但达不到消毒的效果。选择没有腐蚀性的清洗剂对PCR仪的外表面进行清洗。

4.更换保险丝先将PCR仪关机，拔去插头，打开电源插口旁边的保险盒，换上备用的保险丝，观察是否恢复正常。

在仪器的维护保养中，需要注意以下问题：

1.PCR仪器需要定期检测，视制冷方式而定一般半年至少一次。

2.PCR反应的要求温度与实际分布的反应温度是不一致的，当检测发现各孔平均温度差偏离设置温度大于1～2℃时，可以运用温度修正法纠正PCR实际反应温度差。

3.PCR反应过程的关键是升、降温过程的时间控制，要求越短越好，当PCR仪的降温过程超过60s，就应该检查仪器的制冷系统，对风冷制冷的PCR仪要较彻底地清理反应底座的灰尘；对其他制冷系统应检查相关的制冷部件。

4.一般情况如能采用温度修正法纠正仪器的温度时，不要轻易打开或调整仪器的电子控制部件，必要时要请专业人员修理或利用仪器电子线路详细图纸进行维修。

获得诺贝尔奖的PCR技术

1993年，美国科学家Mulis众望所归地获得了诺贝尔化学奖，他所取得的成就是发明了PCR技术。PCR技术神奇就神奇在以下几个特点上：一是被扩增的DNA所需量极小，理论上讲一个分子就可以用于扩增了；二是扩增效率高，目的基因的量成指数形式扩增，几个小时就扩增1000万倍以上。如今，PCR技术已经被广泛地应用于生命科学研究、食品卫生、医疗、法医及环境监测等诸多方面，真不愧是“获得诺贝尔奖”的好技术！

文章来源：实验与分析

编辑：亚析